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강력한 아실
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강력한 아실

Jun 06, 2024

Nature Communications 14권, 기사 번호: 1455(2023) 이 기사 인용

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말라리아 기생충을 죽이기 위해 작은 분자가 어떻게 작용하는지 확인하면 새로운 "화학적으로 검증된" 표적이 생길 수 있습니다. Plasmodium falciparum 무성생식기 기생충에 구조적으로 관련이 없는 세 가지 새로운 항말라리아 화합물(MMV665924, MMV019719 및 MMV897615)을 사용하여 압력을 가하고 저항성 기생충 계통에 대한 전체 게놈 서열 분석을 수행함으로써 우리는 P. falciparum acyl-CoA 합성효소의 다중 돌연변이를 확인했습니다. ACS) 유전자 PfACS10(PF3D7_0525100, M300I, A268D/V, F427L) 및 PfACS11(PF3D7_1238800, F387V, D648Y 및 E668K). 대립 유전자 대체 및 열 프로테옴 프로파일링은 PfACS10을 이러한 화합물의 표적으로 검증합니다. 우리는 이 단백질이 조건부 녹다운을 통해 기생충 성장에 필수적임을 입증하고 발현 감소 시 화합물 감수성이 증가하는 것을 관찰합니다. PfACS10을 억제하면 트리아실글리세롤이 감소하고 지질 전구체가 축적되어 그 기능에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. PfACS11 유전자와 그 돌연변이의 분석은 감소된 단백질 안정성을 통해 저항성을 매개하는 역할을 지적합니다.

말라리아 퇴치에 대한 놀라운 진전에도 불구하고 2022년 세계 말라리아 보고서는 20211년에 말라리아로 인해 2억 4,700만 건의 새로운 사례가 발생하고 619,000명이 사망한 것으로 추정했습니다. 제한된 수의 항말라리아 약물 종류가 이 질병을 치료하는 데 사용되며 거의 모든 치료제에 어느 정도 내성이 있습니다. 풍토병 지역의 적어도 일부 Plasmodium falciparum 기생충 개체군에서 발생했습니다. 새로운 경로를 목표로 하는 새로운 항말라리아제를 식별하는 것은 이용 가능한 약물의 레퍼토리를 늘리는 데 필수적입니다.

지난 10년 동안 표현형 스크린에서 P. falciparum에 대해 5백만 개 이상의 화합물이 스크리닝되었으며 낮거나 마이크로몰 이하의 활성을 갖는 25,000개 이상의 히트가 확인되었습니다2,3,4,5,6,7. 이러한 히트 화합물의 화학적으로 검증된 표적을 식별하면 구조 기반 약물 발견, 단편 스크리닝 또는 DNA 인코딩 라이브러리와 같은 강력한 접근 방식의 사용을 촉진하여 말라리아 약물 발견 및 개발을 가속화할 수 있습니다. 말라리아 약물 가속기 컨소시엄(MalDA)은 전체 세포 표현형 스크리닝에서 적중으로 확인된 작은 분자에 초점을 맞춘 화학유전체학 접근법을 통해 P. falciparum에서 새로운 약물 표적을 식별하려고 합니다. 이 컨소시엄의 주요 전략은 저항성 기생충의 시험관 내 진화와 높은 처리량의 차세대 시퀀싱을 적용하여 여러 새로운 표적과 저항 메커니즘을 확인하는 것입니다9,10,11,12.

여기서 우리는 P. falciparum acyl-CoA 합성효소(PfACS)의 보존된 구성원인 후보 약물 표적 PfACS10 및 PfACS11에 대한 새로운 통찰력을 얻기 위해 세 가지 서로 다른 화학 비계(MMV665924, MMV019719 및 MMV897615)를 사용한 시험관 내 저항성 진화 실험에 대한 이전 보고서를 활용합니다. 효소군8,12,13. PfACS 효소는 장쇄 지방산 합성효소(ACSL)와 가장 유사하며, 이는 2단계 ATP 의존 과정에서 선호하는 아실 사슬 12~20의 유리 지방산(FA)을 조효소 A에 결합하여 활성화합니다. , 그 결과 아실-CoA14가 생성됩니다. 진핵생물 ACSL은 특정 FA 기질 길이와 포화도에 대한 선호도를 보여줍니다. 기생충은 숙주로부터 FA를 제거하고 PfACS에 의한 FA의 활성화를 통해 기생충 성장에 필수적인 다양한 지질 종에 FA가 통합될 수 있습니다. 여기에는 지질 방울21,22에 중성 지질(트리아실글리세롤 및 디아실글리세롤)의 축적이 포함됩니다.

대립유전자 대체 및 열 프로테옴 프로파일링을 사용하여 PfACS10이 필수 단백질이자 MMV665924, MMV019719 및 MMV897615의 표적이라는 증거를 제공합니다. PfACS10을 억제하면 트리아실글리세롤이 감소하고 지질 전구체가 축적됩니다. 반면, PfACS11에서 돌연변이의 대립 유전자 대체는 선택된 계통을 표현하지만, 조건부 녹다운 데이터는 PfACS11이 무성 기생충 성장에 필수적이지 않다는 것을 보여 주며, 이는 PfACS11이 직접적인 표적이 되기보다는 저항을 중재할 수 있음을 의미합니다.

 0.01 from globally diverse isolates (www.malariagen.net/pf3k). The length of the bars represents the local MAF of each variant in West (blue) or East (purple) Africa. The selected variants are indicated by red, blue, and yellow arrows. Dark green boxes indicate the ACS motifs: P: P-loop, G: Gate motif, A: Adenine binding site, L: Linker. c Representative dose-response assay for a clonal line of CF04.008 (ACS10 M300, gray) and two clonal lines of CF04.009 (ACS10 M300I, red) from Malawi. Assays were run in triplicate and repeated twice. Shown are the average ±SD and the non-linear regression curve fit for one biological assay run in triplicate. Source data are provided as a Source Data file. MAF minor allele frequency, π pairwise nucleotide diversity within each country, FST divergence./p>0.01 are depicted in orange (Fig. 3 and Supplementary 4). Resistance-associated mutations are depicted in red./p>43% coverage of the P. falciparum proteome. This compares favorably with the coverage reported for previous TPP and cellular thermal shift assays coupled with mass spectrometry (MS-CETSA) studies with P. falciparum37,38. TPP datasets were analyzed using the standard melting temperature (Tm)-based method, as described in an earlier TPP publication39. This analysis assesses individual protein melt curves using several criteria including curve R2, variability in Tm values within the control sample, maximum curve plateau, and minimum slope. Melting point differences (ΔTm = Tm, treated–Tm, control) are then established for every detectable protein. Only the most significantly affected proteins are selected as potential “hits” by applying an FDR-adjusted z-test to ΔTm data. Proteins with a p-value <0.1 in two separate technical replicates are considered “hits”. Hits found in two biological replicas are considered as putative targets./p> 1.5, mapping quality > 40, min base quality score > 18, read depth > 5) to obtain high quality SNPs that were annotated using SnpEff version 4.3t68. BIC-Seq version 1.1.269 was used to discover copy number variants (CNVs) against the parental strain using the Bayesian statistical model. SNPs and CNVs were visually inspected and confirmed using Integrative Genome Viewer (IGV). All gene annotations in the analysis were based on PlasmoDB-48_Pfalciparum3D7 (https://plasmodb.org/plasmo/app/downloads/release-48/Pfalciparum3D7/gff/)./p>25% of samples, or showed high levels of heterozygosity within single infections (>25%). Additionally, 558 genes failed gene-level quality filters (≥20% heterozygous calls or ≥20% missing calls across samples) and were removed from the analysis. Calculations of pairwise nucleotide diversity (π) and Weir and Cockerham’s FST estimator were performed the PfalGeneDiversityStats package71./p>0.8. The statistical significance was calculated using a z-test and only proteins with a p-value < 0.2 in both technical replicates were considered hits. Hits found in two biological replicates were considered putative targets. Alternatively, we used the NPARC method (non-parametric analysis of response curves), a strategy that compares the experimental data to two models: a null model that assumes that drug has no influence on the protein melting behavior, and an alternative model that assumes that drug affects the melting behavior. Any data-driven adjustments to these models were calculated and assessed for statistical significance using an F-test, generating a p-value. All TPP datasets generated with MMV897615 have been deposited to the ProteomeXchange Consortium via the PRIDE partner repository77 under the identifier PXD034937./p>